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近年來，細(xì)胞外囊泡（EV）研究正加速發(fā)展。2011年約有200篇相關(guān)論文發(fā)表，但2016年一年就有1000篇以上的相關(guān)論文發(fā)表，論文內(nèi)容涉及各種生理功能

和病理癥狀。EV大致可分為核內(nèi)體來源的外泌體和細(xì)胞膜來源的微囊泡，但即便是用現(xiàn)在提取精度最高的差速離心法也難以將二者明確分離，所以簡單地將

10,000×g離心后未沉淀的EV稱為Small EV（主要是外泌體）1）。外泌體是由各種細(xì)胞分泌的小型膜囊泡（直徑30~100 nm），存在于大多數(shù)體液（如血液、

尿液、髓液等）和細(xì)胞培養(yǎng)液中。外泌體是由脂質(zhì)雙分子層包被的膜囊泡，產(chǎn)生于稱為多囊泡胞內(nèi)體的胞內(nèi)囊泡中，多囊泡胞內(nèi)體通過與細(xì)胞膜融合將外泌體

釋放到細(xì)胞外。外泌體含核內(nèi)體來源的蛋白質(zhì)（例如ESCRTs等）和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)蛋白（例如Rab GTPase等）、以及細(xì)胞膜來源蛋白（例如CD63、CD81等）

等為代表的各種分泌細(xì)胞來源的蛋白和RNA，同時還含分泌細(xì)胞的細(xì)胞膜來源和內(nèi)體膜來源的脂質(zhì)（如膽固醇和鞘磷脂等）2）。多年來研究人員認(rèn)為外泌體的

作用是參與細(xì)胞內(nèi)廢棄物的排放。但是近年來外泌體在生物體內(nèi)作為運(yùn)載脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA等細(xì)胞間信息傳遞的新型媒介倍受矚目。除了闡明外泌體生理或

病理功能外，面向于臨床應(yīng)用的功能研究也迅速發(fā)展，尤其是診斷、治療和生物標(biāo)記物開發(fā)等。

現(xiàn)在，外泌體研究橫跨幾乎所有的研究領(lǐng)域（免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、內(nèi)分泌、循環(huán)系統(tǒng)等）。例如，免疫細(xì)胞來源的外泌體含有抗原肽/MHC復(fù)合體和各種抗

原，可能控制著免疫細(xì)胞間抗原信息的交換、免疫細(xì)胞活化、非活化等各種免疫應(yīng)答機(jī)制3）。外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中與神經(jīng)回路的控制相關(guān)4），同時各種神經(jīng)退

行性疾病的致病蛋白還可以通過外泌體釋放到細(xì)胞外并傳遞到其他細(xì)胞，與病情發(fā)展密切相關(guān)5）。癌細(xì)胞釋放的外泌體含有大量與血管新生和免疫抑制相關(guān)的

分子，構(gòu)建適合癌細(xì)胞生長的微環(huán)境，促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)展6）。另外，癌細(xì)胞來源的外泌體上的粘著分子表達(dá)形式?jīng)Q定著癌癥向器官的轉(zhuǎn)移途徑7）。最近，有報

告指出脂肪細(xì)胞釋放的外泌體對肝臟的遺傳基因表達(dá)有控制作用8）。許多病毒利用外泌體的產(chǎn)生路徑感染細(xì)胞，受病毒感染的細(xì)菌和寄生蟲通過外泌體控制其

他受細(xì)胞感染的細(xì)菌、寄生蟲的活動9、10）。

上述這些功能幾乎都是通過細(xì)胞分泌到外泌體中的分子引起的。其中，自從在外泌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)分泌細(xì)胞來源的mRNA和miRNA后，外泌體參與細(xì)胞間基因表達(dá)信

息的水平轉(zhuǎn)移的可能性備受矚目11）。這些RNA被外泌體的脂質(zhì)雙分子層膜所保護(hù)，不會被RNase所降解，可以在血液和體液中穩(wěn)定存在。被靶細(xì)胞吞噬的外

泌體通過與內(nèi)體膜融合，將RNA釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。釋放出來的mRNA除了被翻譯為蛋白質(zhì)，還通過miRNA抑制靶基因的翻譯，使得外泌體在靶細(xì)胞內(nèi)

調(diào)控基因表達(dá)。一個外泌體所含的蛋白質(zhì)有數(shù)萬種，mRNA、miRNA的種類有數(shù)千種以上，這些分子的組成因來源細(xì)胞的不同而異，也會根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)而變

化。另外，外泌體中這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與它們在分泌細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)不同，所以可能存在一種外泌體特異蛋白和mRNA/miRNA選擇性積累的機(jī)制。這種特異性可將

外泌體內(nèi)的RNA作為生物標(biāo)記，更進(jìn)一步作為治療開發(fā)的靶點(diǎn)。外泌體中的mRNA一旦被靶細(xì)胞吞噬，可能會引發(fā)該細(xì)胞內(nèi)的功能性蛋白的表達(dá)，但外泌體中

大部分的miRNA是前體而非功能性miRNA，這些miRNA具有何種生理性意義，學(xué)者們還在積極研究。由于外泌體含有各種蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)，研究人員正

將其按細(xì)胞進(jìn)行分類匯總，以建立數(shù)據(jù)庫?ExoCarta。此外，在世界各地分別運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)進(jìn)行大規(guī)模分析工作，而FunRich的

EVplugin已成為一種通用的分析手段。今后，在推進(jìn)外泌體研究方面，各個研究領(lǐng)域的信息共享至關(guān)重要。

運(yùn)用外泌體研發(fā)治療方法和診斷方法

近年來，隨著外泌體的功能逐漸闡明，越來越多的研究著眼于開發(fā)運(yùn)用外泌體功能的治療方法。例如，血液中的成纖維細(xì)胞（間充質(zhì)祖細(xì)胞的一種）所釋放的

外泌體，可以通過促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖和血管新生來促進(jìn)傷口愈合。報告指出，外泌體內(nèi)的促血管生成miRNA、抗炎性miRNA和促膠原蛋白沉淀miRNA

等參與了上述過程12）。從癌癥患者樹突狀細(xì)胞中釋放的外泌體含有各種癌癥細(xì)胞來源的蛋白質(zhì)，可以強(qiáng)化殺傷性T細(xì)胞對癌癥細(xì)胞的特異性反應(yīng)。利用此功能

的抗腫瘤免疫療法，目前正處于初期臨床研究階段13）。另一方面，也有研究嘗試?yán)猛饷隗w的功能抑制發(fā)病機(jī)制。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細(xì)

胞所釋放的外泌體，聚集了高濃度誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的TNF-α，可使類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎惡化14）。通過上述介紹可以知道癌癥細(xì)胞來源的外泌體含有與癌癥進(jìn)展相關(guān)的

分子，神經(jīng)細(xì)胞來源的外泌體含有與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的分子，因此通過抑制或去除這些外泌體，有望抑制疾病發(fā)生。隨著研究的不斷發(fā)展，還會擴(kuò)大外泌

體的功能闡明和臨床應(yīng)用的適應(yīng)性，有望將外泌體應(yīng)用于各種疾病的治療。此外，還可嘗試?yán)猛饷隗w將siRNA和抗癌藥劑等運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)細(xì)胞中。將各種細(xì)胞

粘著分子表達(dá)在外泌體膜表面上，由其形式?jīng)Q定外泌體被運(yùn)往哪一種細(xì)胞，該特性有望用于開發(fā)新型DDS15）。外泌體在體液中十分穩(wěn)定，同時外囊泡所含的

蛋白質(zhì)和RNA被外泌體的脂質(zhì)雙分子層膜所包被而免于降解。另外從收集后長期儲存的體液中所提取到的外泌體仍然比較完整，因此外泌體有望成為臨床檢測

的新型疾病生物標(biāo)記。外泌體與各種疾病的相關(guān)性已經(jīng)查明，特別是釋放到血液中的癌細(xì)胞來源的外泌體，與健康細(xì)胞來源外泌體和組成分子的差異性備受矚

目，并作為癌癥早期的診斷工具，被研究其與癌癥發(fā)展的相關(guān)性16）。此外，尿液中的外泌體有望作為腎臟、前列腺疾病和膀胱疾病的新型診斷標(biāo)記，腦脊液

中的外泌體作為腦部腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的新型標(biāo)記。

外泌體研究的課題和展望

盡管目前已有許多關(guān)于外泌體作用的報導(dǎo)，但是在這些驗證實驗中使用了從體液和培養(yǎng)細(xì)胞上清中純化的高濃縮外泌體，所以可能無法反映它們在活體內(nèi)的真

實性狀。因此，目前尚未闡明該現(xiàn)象是否在活體內(nèi)真實發(fā)生了。確認(rèn)外泌體生理作用的唯一方法就是明確外泌體的釋放機(jī)制，通過促進(jìn)或抑制釋放機(jī)制，分析

會引起何種生理現(xiàn)象，這也是進(jìn)一步研究發(fā)展的方向。甚至生物體內(nèi)的外泌體動態(tài)（哪個外泌體遷移至何處）也會在今后的研究開發(fā)中成為重要的研究課題。

截止目前為止，外泌體純化的方法主要有超速離心法和PEG沉淀法，但利用這些方法提取的外泌體中混有非常多的雜質(zhì)，必須慎重分析所獲得的實驗結(jié)果是否

是由外泌體組成成分所引起的。并且超離法存在操作繁雜、回收率不穩(wěn)定、不能用于定量分析、必須使用昂貴的超速離心機(jī)、無法進(jìn)行多樣品分析檢測等問題

，因此外泌體的研究相對困難，需要盡快開發(fā)可簡單純化高純度外泌體的技術(shù)。因此FUJIFILM Wako著眼于巨噬細(xì)胞的外泌體受體Tim4，制備出Tim4細(xì)胞外

域與磁珠結(jié)合的“Tim4磁珠”17）。由于Tim4以鈣離子依賴性方式與外泌體膜表面的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合，因此用含有螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）的

洗脫緩沖液可將結(jié)合的外泌體釋放出來，從而獲得高純度的完整外泌體。實際上，用Tim4親和法純化的人白血病細(xì)胞釋放的外泌體，其純度與超離法和PEG沉

淀法純化的外泌體相比，可檢測出10~100倍以上的外泌體特異性蛋白，并且?guī)缀鯖]有外泌體以外的雜質(zhì)，由此證明通過該方法可以重復(fù)性良好地純化高純度外

泌體。因此，該方法可以檢測大量目前為止無法檢測的外泌體上的蛋白和RNA。利用Tim4對外泌體的強(qiáng)結(jié)合能力，可用ELISA或FACS高靈敏度檢測和定量外泌

體。此外，以往只能用差速離心法粗略純化的微囊泡，通過運(yùn)用Tim4親和法，可實現(xiàn)高純度純化微囊泡。本指導(dǎo)書中對這些技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)說明，我們期待這

項技術(shù)的有效性受到世界各方好評，并有望貢獻(xiàn)于外泌體和微囊泡的生理功能的分析研究。

外泌體的檢測和分離的難點(diǎn)，以及外泌體的分類方法多樣，導(dǎo)致研究人員尚未統(tǒng)一定義以何種方法純化的細(xì)胞外囊泡可以稱為“外泌體”，如何進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的

解釋和再現(xiàn)性的確認(rèn)是一項難題。近年隨著國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會（ISEV）的設(shè)立、世界性研究者研討會的形成，國際標(biāo)準(zhǔn)的MISEV指南的提案，計劃進(jìn)行和開

始進(jìn)行EV研究的研究人員請務(wù)必閱讀這些方針18、19）。另外為了規(guī)避上述的混亂情況，還建立了記錄各論文實驗條件的EV-TRACK knowledge database20）。

一方面隨著EV研究倍受矚目，各國也啟動了大型研究項目。美國啟動NIH戰(zhàn)略性大型項目Extracellular RNA Communication，國際權(quán)威性會議?Gordon會

議和Keystone Symposia也于2016成立小組會。受歐洲藥物研究開發(fā)公司“創(chuàng)新藥物倡議組織（IMI）”的支持推進(jìn)的CANCER-ID項目也包含了EV研究。2017

年日本選定了EV研究為文部科學(xué)省研究開發(fā)戰(zhàn)略的目標(biāo)之一，期待會加速研究發(fā)展。無論如何，未來EV研究的發(fā)展，需開發(fā)可成為其研究基礎(chǔ)的穩(wěn)定的研究

方法和技術(shù)，期望Tim4親和法可成為其中之一。

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外泌體分離和純化試劑盒

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MagCapture? 外泌體提取試劑盒PS Ver.2可以從細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿 等樣品中高純度且簡便快捷地純化外泌體等細(xì)胞外囊泡。通過應(yīng)用以鈣離子依賴

方式與細(xì)胞外囊泡表面的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合的Tim4，并使用螯合劑實現(xiàn)完整的細(xì)胞外囊泡純化。

純化細(xì)胞外囊泡專用RNA提取試劑盒

純化細(xì)胞外囊泡（EV）用microRNA Extractor? Kit

純化細(xì)胞外囊泡（EV）用microRNA Extractor? 試劑盒可以使用離心柱從外泌體等細(xì)胞外囊泡（Extracellular  Vesicle：EV）中提取包含microRNA在內(nèi)的總

RNA。只需少量洗脫液（20 μL）即可回收高濃度的RNA，因此 適用于二代高通量測序（Next Generation Sequencing，簡稱NGS）。

使用MagCapture? 外泌體分離試劑盒PS Ver.2分離外泌體后，提取RNA并進(jìn)行NGS分析。

外泌體高靈敏度定性分析

PS Capture? 外泌體流式試劑盒

PS Capture? 外泌體流式試劑盒是一款通過運(yùn)用與磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合的Tim4蛋白和磁珠的PS親和法，可將外泌體固定在磁珠上，并使用流式

細(xì)胞儀高靈敏度檢測標(biāo)記蛋白的試劑盒。

※ 使用前需自行準(zhǔn)備表面標(biāo)記蛋白對應(yīng)熒光染料標(biāo)記一抗、或一抗以及熒光染料標(biāo)記二抗。

外泌體檢測用ELISA試劑盒

※1：檢測用二抗會與人、小鼠、大鼠的IgG發(fā)生非特異性反應(yīng)，因此不可用于檢測血清、血漿。 

※2：試劑盒提供的抗體為抗人CD63抗體，因此對人以外的實驗對象進(jìn)行檢測時需要另外準(zhǔn)備合適的抗體。

※3：如使用的不是去除外泌體的FBS，則需要另外檢測FBS來源的PS陽性外泌體。

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